Cốt truyện của Black Mesa gần như giống với cốt truyện của phần game nguyên bản Half-Life năm 1998.[4] Giống như trong trò chơi gốc, người chơi sẽ điều khiển Gordon Freeman, một nhà vật lý lý thuyết bắt đầu làm việc tại cơ sở nghiên cứu Black Mesa. Anh có nhiệm vụ đặt một mẫu vật liệu dị thường vào máy đo khối phổ để phân tích, sử dụng bộ đồ bảo hộ H.E.V Mark IV để làm điều đó một cách an toàn. Tuy nhiên, mẫu thử gây ra một "dòng thác cộng hưởng", nó tàn phá cơ sở và tạo ra một vết nứt giữa các chiều đến một chiều không gian ngoài hành tinh được gọi là Xen, đưa các sinh vật ngoài hành tinh của nó đến Trái Đất. Gordon sống sót sau sự cố, tìm thấy những người sống sót khác, và được giao nhiệm vụ đi lên trên để kêu gọi sự giúp đỡ. Tuy nhiên, khi lên đến bề mặt, anh ta phát hiện ra rằng cơ sở đang được quân đội thực hiện "dọn dẹp" sạch sẽ bất kỳ sinh vật sống nào - dù con người hay người ngoài hành tinh. Gordon biết được từ các nhà khoa học sống sót cách duy nhất để ngăn chặn cuộc xâm lược của người ngoài hành tinh là vượt qua Xen và tiêu diệt một thực thể có tên là Nihilanth. Bởi chỉ khi Nihilanth chết, cuộc xâm lăng của người ngoài hành tinh mới chấm dứt.

• Xem thêm: Cốt truyện chi tiết và đầy đủ của Half-Life.